另外细菌的耐药性也可通过改变青霉素结合蛋白结构，使青霉素不能与靶位蛋白充分结合或亲和力下降，属于这类耐药机制的细菌有耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。

青霉素对溶血性链球菌、肺炎链球菌和不产青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。对肠球菌有中度抗菌作用。淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽胞杆菌、牛型放线菌、念珠状链杆菌、钩端螺旋体和梅毒螺旋体对本品敏感。本品对流感嗜血杆菌和百日咳鲍特菌亦具一定抗菌活性，革兰阴性需氧或兼性厌氧菌等铜绿假单胞菌对本品敏感性差，故选D。

β内酰胺类药物是通过干扰细菌细胞壁肽聚糖的合成而显杀菌作用。β内酰胺类药物可抑制转肽酶的活性，从而阻止了肽聚糖的合成，导致细胞壁缺损，引起细菌细胞死亡。同时β内酰胺类药物可增加细菌细胞壁自溶酶的活性，产生自溶或胞壁质水解，使细菌裂解死亡。

青霉素能抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白（PBPs），从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解。

青霉素主要作用于革兰阳性菌、革兰阴性球菌、嗜血杆菌属以及各种致病螺旋体等。为治疗A组和B组溶血性链球菌感染、敏感葡萄球菌感染、气性坏疽、梅毒、鼠咬热等的首选药。肺炎球菌感染和脑膜炎时也可采用，当病原菌比较耐药时，可改用万古霉素或利福平。青霉素也是治疗草绿色链球菌心内膜炎的首选药。还可作为放线菌病、钩端螺旋体病、梅毒、回归热等及预防感染性心内膜炎发生的首选药。破伤风、白喉患者采用青霉素时应与抗毒素合用。最常见的不良反应是过敏反应。